Nguyễn Việt Trung 1, Nguyễn Thị Huyền 2, Trần Thị Huyền Trang 1, Đào Ngọc Bắc 1, Đoàn Thị Kim Phượng 1, Lương Thị Lan Anh 1, Phạm Đình Minh 2, Vũ Thị Hà 1,1 Đại học Y Hà Nội2 doanh nghiệp Cổ phần Dịch vụ so sánh Di truyền Gentis |
TÓM TẮT
Tinh trùng bị lệch bội nhiễm sắc thể (NST) bao gồm thể trực tiếp khiến ảnh hưởng xấu tới kết quả thai kỳ. Hiện nay, phương pháp lai huỳnh quang quẻ tại chỗ (FISH) là một vào những phương pháp phổ biến nhất và bao gồm nhiều ưu thế trong việc xác định sự lệch bội những NST trong tế bào tinh trùng.
Bạn đang xem: Ưu điểm của kỹ thuật fish
Mục tiêu: hoàn thiện các bước kỹ thuật lai huỳnh quang quẻ tại chỗ trong so sánh lệch bội nhiễm sắc thể từ tế bào tinh trùng.
Đối tượng và phương pháp: 15 mẫu tinh dịch được thực hiện lai huỳnh quang tại chỗ để so sánh tỉ lệ lệch bội NST tinh trùng tại Trung tâm Di truyền lâm sàng- Bệnh viện Đại học Y Hà Nội và Trung vai trung phong Xét nghiệm quốc tế Gentis - công ty cổ phần dịch vụ so sánh di truyền Gentis.
Kết quả: 15/15 mẫu tinh trùng thực hiện thành công xuất sắc kỹ thuật lai huỳnh quang quẻ tại chỗ để đối chiếu lệch bội đến 5 NST (13, 18, 21, X, Y).
Kết luận: Kỹ thuật FISH thực hiện qua nhiều giai đoạn, mỗi giai đoạn đều gồm những đặc điểm riêng phù hợp với đặc điểm cấu tạo, tính chất màng tế bào và DNA tinh trùng, để đảm bảo quá trình thành công và kết quả so với rõ ràng, cho phép phát hiện đúng mực tỉ lệ lệch bội NST từ tế bào tinh trùng.
Từ khoá:lai huỳnh quang đãng tại chỗ, nhiễm sắc thể tinh trùng, lệch bội nhiễm sắc thể
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Phân tích tinh dịch ở phái mạnh giới là phương pháp cơ bản cùng trực quan nhất để đánh giá bán khả năng sinh sản của một người phái nam giới. Các chỉ số so sánh tinh dịch cơ bản bao gồm: mật độ tinh trùng, tổng số lượng tinh trùng, hình thái, khả năng di động của tinh trùng… nhưng thường ko đánh giá được vật chất di truyền của những tế bào tinh trùng. Vật chất di truyền của tế bào tinh trùng tất cả thể ảnh hưởng trực tiếp tới sự thụ tinh tạo phôi, cũng như kết quả của bầu kỳ, từ đó khiến hậu quả là người nam giới mắc vô sinh hiếm muộn, khiến sảy thai, thai lưu, hoặc gồm thể là sinh ra bé mắc những dị tật di truyền như lệch bội nhiễm sắc thể (NST). Lệch bội NST tinh trùng là một chỉ số được cho phép đánh giá bán trực tiếp vật chất di truyền của tế bào tinh trùng.
Lai huỳnh quang đãng tại chỗ (fluorescence in situ hybridization - FISH) là một phương pháp phổ biến nhất cùng hiệu quả nhất để đánh giá chỉ tình trạng lệch bội NST tinh trùng người 1, 2. Nguyên tắc của kỹ thuật FISH là sử dụng mẫu DNA dò lai với trình tự ADN của mẫu bệnh phẩm bằng trình tự bổ sung, nhờ đó vạc hiện, định vị được chuỗi ADN đặc hiệu qua so với dưới kính hiển vi huỳnh quang,’ xác định các bất thường NST cụ thể về số lượng hoặc cấu trúc. Kỹ thuật FISH thực hiện trên những tế bào nguyên vẹn màng tế bào, được cho phép đánh giá vật chất di truyền ở từng tế bào riêng lẻ.
Trên thế giới, kỹ thuật FISH để vạc hiện lệch bội NST tinh dịch đã được thực hiện từ lâu. Nhiều nghiên cứu mang lại thấy tỉ lệ lệch NST bội tinh dịch cao có tương quan đến các tình trạng vô sinh hiếm muộn, sảy bầu nhiều lần vị nam giới 3, 4, 5, 6, 7, thậm chí ảnh hưởng tới kết quả của những biện pháp hỗ trợ sinh sản, đặc biệt là phương pháp tiêm tinh dịch vào bào tương trứng (ICSI)8, 9, 10. Xung quanh ra, tỉ lệ lệch bội NST tinh trùng còn được đến là có mối liên hệ đang kể với các chỉ số phân tích tinh dịch không giống như: mật độ tinh trùng, mức độ phân mảnh DNA tinh trùng 5, 11, 12, 13
Ở Việt Nam, việc kỹ thuật FISH để so với tỉ lệ lệch bội NST tinh dịch là còn rất mới. Kỹ thuật này đòi hỏi tiến trình thực hiện phức tạp với nghiêm ngặt, nhân lực được đào tạo sâu xa về việc đối chiếu cũng như tư vấn kết quả. Thực hiện kỹ thuật này thành công được cho phép bác sĩ tất cả thêm chỉ số để đánh giá chỉ khả năng sinh sản của phái nam giới, cũng như việc áp dụng trong số nghiên cứu về vấn đề vô sinh hiếm muộn, bất thường sinh sản ở phái nam giới.
Vì vậy, mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là:Hoàn thiện kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ để phân tích tỉ lệ lệch bội NST tinh trùng
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu đáp ứng những yêu cầu:
+ Lấy mẫu tinh dịch theo đúng hướng dẫn của WHO mang lại phân tích tinh dịch
+ Mẫu tinh dịch được đối chiếu cơ bản
- Thời gian nghiên cứu: từ 04/2022 đến 07/2022
- Địa điểm: Trung chổ chính giữa Di truyền lâm sàng với hệ gen, bệnh viện Đại học Y hà Nội; trung trung ương xét nghiệm quốc tế Gentis, doanh nghiệp cổ phần dịch vụ so sánh di truyền Gentis.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tế bào tả cắt ngang
2.2.1. Lấy mẫu tinh dịch: theo huớng dẫn của WHO (2021) mang lại mẫu để phân tích tinh dịch
2.2.2. Cố dịnh tế bào: nhược trương tế bào, sử dụng dung dịch Carnoy (3 Methanol: 1 Acid axetic) để rửa sạch cùng cố định tế bào tinh dịch trên các lam kính
2.2.3. Bộc lộ DNA tinh trùng: sử dụng Ethanol để khử nước và dung dịch dithiothreitol (DTT) để bộc lộ DNA của tinh trùng
2.2.4. Lai tín hiệu: sử dụng bộ kit Cytocell prenatal enumeration FISH probe cho những NST: 13, 18, 21, X, Y.
2.2.5. So với kết quả: dựa trên những tiêu chuẩn nghiêm ngặt tất cả sẵn
2.2.6. Xử lí số liệu
2.3. Đạo đức nghiên cứu
Các số liệu và thông tin nghiên cứu là chủ yếu xác, trung thực, khách hàng quan và được chấp thuận bởi cơ sở nghiên cứu. Bệnh nhân hoặc người giám hộ hoàn toàn tự nguyện thâm nhập vào nghiên cứu. Bệnh nhân và người công ty bệnh nhân sẽ được thông tin về kết quả xét nghiệm để giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác hoạ đồ điều trị phù hợp. Những thông tin cá thể sẽ được đảm bảo túng thiếu mật với chỉ phục vụ công tác làm việc nghiên cứu
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Cố định tế bào
Trước lúc cố định tế bào tinh dịch bằng dung dịch Carnoy, những tế bào tinh trùng được bỏ vào trong môi trường nhược trương (dung dịch KCl) nhằm có tác dụng giản nở không khí giữa các NST, làm những sợi DNA dễ được bộc lộ hơn ở bước sau. Sau đó tế bào tinh trùng được trải đều cùng cố định trên các lam kính.
Hình 3.1. Hình ảnh tín hiệu lai vào tế bào tinh trùng với những mức độ nhược trương không giống nhau
Nhận xét: Thời gian lai khác nhau cho những kết quả lai khác nhau: lai trong thời gian ngắn (2h), những tín hiệu lai chỉ xuất hiện ở những tế bào bạch cầu, mà không có trong những tế bào tinh trùng. Khi thực hiện lai vào thời gian trung bình (12h), tín hiệu lai không rõ rệt xuất hiện vào một số tế bào tinh tùng; lúc thực hiện lai vào thời gian nhiều năm (24h), tín hiệu lai rõ rệt xuất hiện ở hầu hết các tế bào tinh trùng.
Phân tích kết quảKết quả lai được đọc trên kính hiển vi huỳnh quang với các filter lọc tất cả thông số phù hợp với bước sóng phạt ra từ những probe tương ứng. Việc đánh giá các tín hiệu lai trong tế bào cần đảm bảo các yêu cầu nghiêm ngặt 1, 14, 15, 16: chỉ đánh giá những tế bào tinh trùng gồm đường viền nguyên vẹn và nhân giới hạn rõ ràng; các tín hiệu lai phải cụ thể (trong một tế bào, khi bao gồm 2 tín hiệu lai cùng màu, thì các tín hiệu phải biện pháp nhau không nhiều nhất một khoảng phương pháp tương đương với 1 tín hiệu thăm dò). Các tế bào được coi là bất thường khi có nhiều hơn 1 tín hiệu mang lại cùng một NST được phạt hiện. Lúc không phát hiện được tín hiệu của một NST, cần để mắt tới đó là kết quả của sự lai thất bại hay bởi bất thường NST.
Hình 3.3. Hình ảnh những tín hiệu lai bình thường cùng bất thường ở tế bào tinh trùng
Nhận xét: các tế bào được đối chiếu dựa trên các tiêu chuẩn nghiêm ngặt gồm sẵn 1, 14, 15, 16
Vì số lượng các tế bào tinh trùng của mỗi người thường là rất nhiều, nhưng tỉ lệ dị bội lại rất thấp, do vậy cần so sánh số lượng lớn các tế bào tinh trùng để tất cả thể phạt hiện ra các tế bào dị bội. Tuy nhiên, việc đánh giá số lượng thừa lớn mang lại mỗi bệnh nhân vào thực hành lâm sàng là không khả thi, bởi tiêu tốn quá nhiều thời gian cũng như nhân lực thực hiện. Theo nhiều nghiên cứu, để kết quả đánh giá được toàn diện với khách quan liêu nhất, số lượng tế bào cần phân tích mang đến mỗi bệnh nhân là ít nhất 1000 tế bào 17, 18.
Xem thêm: Chương trình giáo dục trẻ mẫu giáo 5 lĩnh vực phát triển của trẻ 5-6 tuổi
Bảng 3.3. Mật độ, số lượng tinh trùng cùng số tế bào tinh trùng được đối chiếu số lượng NST
Tổng số tinh trùng (triệu/ ml) | Số lượng mẫu | Tín hiệu lai | Số tế bào phân tích (TB/ probe) |
3 – 5 | 2 | Tốt | Dưới 700 |
6 - 15 | 3 | Tốt | Trên 1000 |
30 - 140 | 10 | Tốt | Trên 1000 |
Nhận xét: Tất cả những mẫu tinh trùng đều được thực hiện thành công xuất sắc kỹ thuật FISH, nhưng các mẫu có tổng số tinh trùng từ dưới 6 triệu tinh trùng/ mẫu không đủ tế bào để thực hiện so với kết quả.
IV. BÀN LUẬN
FISH là một kỹ thuật cực nhọc với quá trình nhiều bước, thao tác làm việc phức tạp. Các bước FISH sử dụng mẫu tinh dịch tất cả nhiều điểm khác biệt so với mẫu những tế bào soma (mẫu ngày tiết ngoại vi, mẫu tế bào ối), vì chưng vậy thừa trình làm việc quy trình đòi hỏi sự chính xác và ghê nghiệm từ người thực hiện được đào tạo chuyên sâu.
Bảng 4.1. So sánh sự khác biệt của quy trình FISH bên trên tinh trùng với tế bào soma
Giai đoạn | FISH trên tinh trùng | FISH bên trên TB soma |
Cố định tế bào | Cần nhược trương tế bào đủ | Có thể nhược trương tế bào hoặc không |
Bộc lộ DNA tinh trùng | Sử dụng dung dịch DTT để bộc lộ DNA tế bào | Không cần sử dụng dung dịch DTT |
Phân tích kết quả | Đọc kết quả là tế bào đơn bội (n):1 tín hiệu mang lại mỗi NST | Đọc kết quả là tế bào lưỡng bội (2n): 2 tín hiệu mang đến mỗi NST |
Trong các tế bào soma và tế bào trứng, những sợi nhiễm sắc được cấu tạo bởi các nucleosome dựa trên các protein histone, nhưng vào tế bào tinh trùng, 85% protein histon được nỗ lực thế bằng protamine 19, 20. Protamine bao gồm vai trò quan lại trọng vào việc bảo vệ tính toàn vẹn DNA của tinh dịch khỏi các gốc tự vày , cùng giúp ngưng tụ chất nhiễm sắc của tinh trùng, nén những sợi nhiễm sắc của tinh trùng hơn gấp 10 lần so với ở các tế bào soma 20. Chủ yếu sự nén chặt của chất nhiễm sắc vào tế bào tinh dịch là lý do dẫn đến sự khó bộc lộ sợi DNA khi thực hiện kỹ thuật FISH. Quá trình nhược trương tế bào cần đủ để tế bào tinh dịch được mở rộng không khí chứa đựng những sợi nhiễm sắc, làm những hoá chất sử dụng dễ tiếp cận với sợi nhiễm sắc. Giữa những phân tử protamine có những liên kết disulfide - đóng vai trò góp ổn định sự ngưng tụ chất nhiễm sắc, bất hoạt tạm thời những sợi DNA, làm những sợi nhiễm sắc trơ với hoạt động của những enzyme 21. DTT là hoá chất tất cả khả năng cắt đứt các cầu nối disulfide này, giúp giải phóng sợi DNA khỏi sự gắn kết với protamine để bao gồm thể tiến hành quy trình lai
Với tiến trình kỹ thuật được shop chúng tôi xây dựng, tỉ lệ thực hiện thành công xuất sắc là 100% (15/15 mẫu). Mặc dù có 2 mẫu với tổng số lượng tinh trùng dưới 5 triệu tinh trùng/ mẫu, mặc dù vẫn lai thành công xuất sắc tín hiệu huỳnh quang, nhưng không đáp ứng đủ số lượng tế bào bị phân tích. Các làm việc thực hiện cách thức: ly trọng tâm loại bỏ dịch nổi, cố định tế bào tinh trùng lên lam kính, xuất xắc diện tích lai hoá là yếu tố làm mất một số lượng tinh trùng, và một số ko được lai hoá. Những nguyên nhân này khiến số lượng tế bào thực tế được lai hoá là rất không nhiều so với tổng số tế bào tinh dịch ban đầu bao gồm trong mẫu. Để khắc phục vấn đề này, các thao tác làm việc cần được thực hiện đúng mực để tiết kiệm tối đa số tinh trùng thu được để phân tích.
Sự so sánh kết quả thu được cần dựa vào các tiêu chuẩn nghiêm ngặt đã được đưa ra từ nhiều tác giả 1, 14, 15, 16 cũng như từ nhà sản xuất. Các tiêu chuẩn nghiêm ngặt này đảm bảo sự khách quan để đánh giá chỉ kết quả. Phân tích số lượng lớn những tế bào cho mỗi mẫu là cần thiết để đảm bảo kết quả được đúng đắn và toàn diện nhất. Tuy nhiên phân tích số lượng thừa lớn đến mỗi mẫu là ko khả thi. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy phân tích 1000 tinh trùng là cần thiết để cung cấp tin tức đáng tin cậy.
V. KẾT LUẬN
Trong số 15 mẫu tinh dịch thực hiện tiến trình FISH, 100% những mẫu đều được thực hiện thành công xuất sắc kỹ thuật. Do sự khác biệt giữa cấu trúc những loại tế bào, kỹ thuật FISH thực hiện bên trên tế bào tinh trùng không thể dùng các quy trình thông thường mang lại tế bào lympho máu ngoại vi. Các bước đòi hỏi người thực hiện phải được đào tạo nâng cao và có nhiều khiếp nghiệm về kỹ thuật thực hiện cũng như phân tích kết quả.
Quy trình kỹ thuật của chúng tôi vẫn còn một số nhược điểm về yêu cầu số lượng tinh dịch trong mẫu ban đầu. Bởi vậy, việc cải tiến kỹ thuật là luôn cần thiết để cải thiện hiệu quả cùng đơn giản hoá quy trình.
CLICK Tại đây để xem bài bác được đăng tải trên Tạp chí Y học Việt Nam
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Thời gian làm việc: thăm khám bệnh: 7h-16h (Thứ 2-Thứ 6), 7h-12h (Sáng sản phẩm công nghệ 7), trừ nghỉ lễ ----- chào đón cấp cứu giúp và điều trị nội trú 24/7, bao gồm cả nghỉ lễGIỚI THIỆUTIN TỨCDÀNH đến NVYTDÀNH mang đến NGƯỜI BỆNHTRA CỨUĐặt lịch khám
TT Ghép Tạng
Bệnh viện hữu hảo Đa khoa nghệ an > Y học thường xuyên thức > Ứng dụng kỹ thuật Fish phân phát hiện một vài bất thường di truyền trong chẩn đoán cùng điều trị các bệnh tiết ác tính
Ứng dụng kỹ thuật Fish phân phát hiện một vài bất thường dt trong chẩn đoán với điều trị các bệnh tiết ác tính
FISH (Fluorescent insitu hybridization – nghệ thuật lai huỳnh quang tại chỗ) là kỹ thuật trung gian giữa dt tế bào với di truyền phân tử, áp dụng một đoạn mồi đặc hiệu (probe) gắn biểu thị huỳnh quang, để phát hiện sự xuất hiện hoặc vắng khía cạnh của một đoạn gene nào kia trên nhiễm sắc thể, với ưu thế nhanh, đặc hiệu và chính xác. FISH đặc biệt có công dụng trong bài toán phát hiện gần như mất đoạn gene nhỏ (microdeletion), hoặc để khẳng định bắt đầu của các loại chuyển đoạn quánh biệt.
Kỹ thuật FISH thường xuyên được ứng dụng để chỉ định trong số trường hợp
Chẩn đoán trước sinh những bất thường số lượng NST ngơi nghỉ thai nhi.Phát hiện những mất đoạn nhỏ ở một trong những hội hội chứng di truyền.Xác định các đoạn nhiễm nhan sắc thể chưa rõ mối cung cấp gốc.Phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể sệt hiệu vào ung thư.phi lý di truyền trong những bệnh ngày tiết ác tính khôn xiết đa dạng, bao gồm bất thường xuyên nhiễm sắc đẹp thể (chuyển đoạn, mất/ thêm đoạn, đảo đoạn, mất hoặc thêm nhiễm nhan sắc thể) và những đột đổi thay gen (thay thế, chèn xóa,…). FISH được coi là kỹ thuật đặc hiệu để phát hiện các bất thường di truyền điển hình có thể được thực hiện để chẩn đoán hoặc để xếp các loại tiên lượng bệnh. Ví dụ: trong Đa u tủy xương ( milimet ) thường gặp gỡ những không bình thường chuyển cùng xóa đoạn như t(11;14), t(4;14), t(6;14), t(14;16), t(14;20), del(13q), del(17p); trong bệnh lý Lơ xê ngươi lympho mạn (CLL), FISH phạt hiện các bất thường: +12, del (11q), del (13q), del (17p)….. Ngoài ra, các bệnh lý huyết học tập có xu hướng phát sinh mẫu tế bào với đột biến bắt đầu trong quá trình điều trị, đặc biệt là điều trị không hiệu lực thực thi hoặc tái phát, ví như đột trở thành kháng dung dịch TKI ở bệnh dịch CML. Bởi vì vậy, phối kết hợp các phương thức di truyền tế bào với sinh học tập phân tử nhằm chẩn đoán với theo dõi điều trị bệnh máu ác tính là cực kỳ quan trọng.
Med năm ngoái )Figure 2 Hình hình ảnh minh họa không bình thường chuyển đoạn t(11;14)(q13;q32)
Direct năm 2020 )Khoa Di truyền cùng Sinh học tập phân tử, cơ sở y tế Hữu Nghị đa khoa tỉnh nghệ an hiện đang tiến hành kỹ thuật FISH với các đầu dò t(4;14), t(14,16), del (13q), del (17p), del (5q), del (7q), del (20q)… sệt hiệu cho một vài bệnh máu ác tính như Đa u tủy xương , Hội chứng rối loạn sinh tủy… Với những trang thiết bị hiện đại, cán cỗ xét nghiệm chăm ngành dt – Sinh học phân tử được đào tạo liên tiếp và bồi dưỡng trình độ thường xuyên, bọn chúng tôi cam đoan đưa ra kết quả xét nghiệm bao gồm xác, tin cậy, bảo đảm chất lượng.
Để để lịch khám, Qúy người sử dụng vui lòng liên hệ